DiaNN
DIA-NN 1.9.2
DIA-NN – eine universelle Software-Suite für die datenunabhängige Erfassung (DIA) proteomischer Datenverarbeitung. DIA-NN wurde an der Universität Cambridge, Großbritannien, im Labor von Kathryn Lilley (Cambridge Centre for Proteomics) konzipiert und schlug ein neues Kapitel in der Proteomik auf, indem es eine Reihe von Algorithmen einführte, die zuverlässige, robuste und quantitativ genaue groß angelegte Experimente ermöglichten Hochdurchsatzverfahren. DIA-NN wird derzeit im Labor von Vadim Demichev an der Charité (Universitätsmedizin Berlin, Deutschland) weiterentwickelt.
DIA-NN basiert auf den folgenden Prinzipien:
Download : https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/1.9.2 (es wird empfohlen, die neueste Version zu verwenden – DIA-NN 1.9.2)
Bitte zitieren:
DIA-NN: Neuronale Netze und Interferenzkorrektur
ermöglichen eine tiefe Proteomabdeckung im Hochdurchsatz Nature Methods, 2020
Verwendung von DIA-NN für die Analyse von Posttranslationsmodifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung oder Ubiquitinierung: Zeitaufgelöstes in vivo-Ubiquitinom-Profiling durch DIA-MS enthüllt USP7-Ziele im proteomweiten Maßstab Nature Communications, 2021
Verwendung des Ionenmobilitätsmoduls von DIA-NN für die timsTOF-Datenanalyse oder Verwendung von DIA-NN in Kombination mit FragPipe-generierten Spektralbibliotheken: dia-PASEF-Datenanalyse mit FragPipe und DIA-NN für tiefe Proteomik bei geringen Probenmengen Nature Communications, 2022
Verwendung von DIA-NN für die Analyse von Multiplex-Proben (SILAC, mTRAQ usw.): Steigerung des Durchsatzes empfindlicher Proteomik durch plexDIA Nature Biotechnology, 2022
Verwendung von DIA-NN als Teil des CysQuant-Workflows: CysQuant: Gleichzeitige Quantifizierung der Cysteinoxidation und der Proteinhäufigkeit mithilfe datenabhängiger oder unabhängiger Erfassungsmassenspektrometrie Redox Biology, 2023
Verwendung des QuantUMS-Moduls von DIA-NN zur Quantifizierung: QuantUMS: Unsicherheitsminimierung ermöglicht zuverlässige Quantifizierung in der Proteomik
Verwendung von DIA-NN zur Verarbeitung von Slice-PASEF-Daten: Slice-PASEF: Fragmentierung aller Ionen für maximale Empfindlichkeit in der Proteomik- Biorxiv
Andere wichtige Papiere
R-Paket mit einigen nützlichen Funktionen für den Umgang mit den Ausgabeberichten von DIA-NN: https://github.com/vdemichev/diann-rpackage
Visualisierung der Peptidpositionen im Protein: https://github.com/MannLabs/alphamap (AlphaMap von Mann lab)
Hinweise und Diskussionen zur Proteomik im Allgemeinen und zur Verwendung von DIA-NN: https://github.com/vdemichev/DiaNN/discussions/categories/dia-proteomics-in-detail (dieser Abschnitt wird weiter ausgebaut).
Installation
Erste Schritte
Rohdatenformate
Spektralbibliotheksformate
Ausgabe
Bibliotheksfreie Suche
Erstellung von Spektralbibliotheken
Match-Between-Runs
Standardeinstellungen ändern
Befehlszeilentool
Visualisierung
Automatisierte Pipelines
PTMs und Peptidoformen
Multiplexen mit plexDIA
Referenz zu den GUI-Einstellungen
Befehlszeilenreferenz
Hauptausgabereferenz
Häufig gestellte Fragen (FAQ)
Unterstützung
Laden Sie unter Windows das .exe-Installationsprogramm herunter und führen Sie es aus. Stellen Sie sicher, dass Sie das Installationsprogramm nicht von einem Netzlaufwerk ausführen. Es wird empfohlen, DIA-NN in dem vom Installationsprogramm vorgeschlagenen Standardordner zu installieren. Alternativ entpacken Sie einfach das .binaries.zip-Archiv an einen Speicherort Ihrer Wahl.
Laden Sie unter Linux die Datei .Linux.zip herunter und entpacken Sie sie. Die Linux-Version von DIA-NN wird auf Linux Mint 21.2 generiert und das Zielsystem muss über mindestens ebenso aktuelle Standardbibliotheken verfügen. Eine solche Anforderung besteht jedoch nicht, wenn Sie ein Docker- oder Apptainer/Singularity-Container-Image erstellen. Um einen der Container zu generieren, empfehlen wir, mit dem neuesten Debian-Docker-Image zu beginnen – in diesem Fall müssen Sie nur sudo apt install libgomp1 installieren, bevor Sie DIA-NN darin ausführen können. Bitte beachten Sie auch den hervorragenden ausführlichen Leitfaden von Roger Olivella. Um die beste Leistung zu erzielen, verwenden Sie mimalloc mit dynamischer Überschreibung, wie hier beschrieben: https://github.com/microsoft/mimalloc.
Es ist auch möglich, DIA-NN unter Linux mit Wine 6.8 oder höher auszuführen.
DIA-Massenspektrometriedaten können auf zwei Arten analysiert werden: durch Suche in einer Sequenzdatenbank (bibliotheksfreier Modus) oder durch Verwendung einer „Spektralbibliothek“ – einem Satz bekannter Spektren und Retentionszeiten für ausgewählte Peptide. Wir besprechen im Abschnitt „Bibliotheksfreie Suche“ ausführlich, wann jeder dieser Ansätze verwendet werden sollte. Für beide Arten von Analysen ist die Verwendung von DIA-NN sehr einfach:
Nun reichen die oben genannten Informationen aus, um mit der Verwendung von DIA-NN zu beginnen, es ist tatsächlich so einfach! Der Rest dieser Dokumentation kann hilfreich sein, ist jedoch für 99 % der Projekte nicht unbedingt erforderlich.
Im Folgenden erfahren Sie, wie Sie DIA-NN mit den Standardeinstellungen ausführen, die für die meisten Experimente eine optimale oder nahezu optimale Leistung liefern. In manchen Fällen ist es jedoch besser, die Einstellungen anzupassen. Weitere Einzelheiten finden Sie unter Standardeinstellungen ändern.
DIA-NN bietet außerdem leistungsstarke Tuning-Optionen für ausgefallene Experimente. DIA-NN ist als benutzerfreundliche grafische Oberfläche implementiert, die automatisch ein Befehlszeilentool aufruft. Der Benutzer kann Optionen/Befehle aber auch direkt über das Textfeld „Zusätzliche Optionen“ in der Benutzeroberfläche an das Befehlszeilentool übergeben. Alle diese Optionen beginnen mit einem doppelten Bindestrich – gefolgt vom Optionsnamen und gegebenenfalls einigen einzustellenden Parametern. Wenn Sie also in dieser Dokumentation eine Option/einen Befehl mit -- im Namen sehen, bedeutet dies, dass dieser Befehl in das Textfeld „Zusätzliche Optionen“ eingegeben werden soll.
Unterstützte Formate: Sciex .wiff, Bruker .d, Thermo .raw, .mzML und .dia (Format, das von DIA-NN zum Speichern von Spektren verwendet wird). Die Konvertierung von jedem unterstützten Format in .dia ist möglich. Bei der Ausführung unter Linux (native Builds, nicht Wine) werden nur .d-, .mzML- und .dia-Daten unterstützt.
Für .wiff-Unterstützung laden Sie ProteoWizard herunter und installieren es – wählen Sie die Version (64-Bit), die „Herstellerdateien“ unterstützt. Kopieren Sie dann alle Dateien mit „Clearcore“ oder „Sciex“ im Namen (dies werden .dll-Dateien sein) aus dem ProteoWizard-Ordner in den DIA-NN-Installationsordner (der Ordner, der diann.exe, DIA-NN.exe und a enthält). eine Menge anderer Dateien).
Zum Lesen von Thermo-.raw-Dateien muss Thermo MS File Reader installiert sein. Es ist unbedingt erforderlich, speziell die Version unter dem obigen Link (3.0 SP3) zu verwenden.
.mzML-Dateien sollten zentriert sein und Daten als Spektren (z. B. SWATH/DIA) und nicht als Chromatogramme enthalten.
Viele Massenspezifikationsformate, einschließlich der wenigen, die nicht direkt von DIA-NN unterstützt werden, können mit der MSConvertGUI-Anwendung von ProteoWizard in .mzML konvertiert werden. Dies funktioniert für alle unterstützten Formate außer Bruker .d und SCIEX Scanning SWATH – auf diese muss DIA-NN direkt zugreifen. Für die Konvertierung müssen die folgenden MSConvert-Einstellungen verwendet werden:
DIA-NN unterstützt durch Kommas getrennte (.csv), tabulatorgetrennte (.tsv, .xls oder .txt) oder .parquet-Tabellen als Spektralbibliotheken sowie .speclib (kompaktes Format, das von DIA-NN verwendet wird) und .sptxt (SpectraST, experimentell) und .msp (NIST, experimentell) Bibliotheksdateien. Wichtig: Die Bibliothek darf keine unfragmentierten Vorläuferionen als „Fragmente“ enthalten: Jedes Fragmention muss tatsächlich durch die Fragmentierung des Peptidrückgrats erzeugt werden.
Bibliotheken im PeakView-Format sowie Bibliotheken, die von FragPipe, TargetedFileConverter (Teil von OpenMS) erstellt, von Spectronaut (Biognosys) im .xls-Format exportiert oder von DIA-NN selbst generiert wurden, werden „wie besehen“ unterstützt.
Für .tsv/.xls/.txt-Bibliotheken, die auf andere Weise generiert wurden, erfordert DIA-NN möglicherweise die Angabe der Header-Namen (durch Kommas getrennt) (für die erforderlichen Spalten) mithilfe des Befehls --library-headers. Verwenden Sie das *-Symbol anstelle des Namens einer Kopfzeile, damit diese automatisch erkannt wird. Nachfolgend finden Sie die Beschreibungen der jeweiligen Spalten (in der Reihenfolge, in der die Überschriften angegeben werden müssen).
Erforderliche Spalten:
Es wird dringend empfohlen, dass in der Bibliothek auch Spalten vorhanden sind, die Folgendes enthalten:
Ein Befehl --library-headers, der alle Spaltennamen außer der Spalte „Decoy“ angibt, kann beispielsweise so aussehen:
--library-headers ModifiedPeptide,PrecursorCharge,PrecursorMz,Tr_rekalibriert,ProductMz,LibraryIntensity,UniprotID,ProteinName,Genes,Proteotypic,*,FragmentCharge,FragmentType,FragmentSeriesNumber,FragmentLossType,QValue,ExcludeFromAssay,IonMobility
Verwenden Sie --sptxt-acc, um die Massengenauigkeit der Fragmentfilterung (in ppm) beim Lesen von .sptxt/.msp-Bibliotheken festzulegen.
MaxQuant msms.txt kann auch (experimentell) als Spektralbibliothek in DIA-NN verwendet werden, obwohl feste Änderungen möglicherweise nicht korrekt gelesen werden.
DIA-NN kann jede unterstützte Bibliothek in sein eigenes .parquet-Format konvertieren . Klicken Sie dazu auf Spektralbibliothek ( Eingabebereich ), wählen Sie die Bibliothek aus, die Sie konvertieren möchten, wählen Sie den Dateinamen der Ausgabebibliothek ( Ausgabebereich ) und klicken Sie auf Ausführen . Wenn Sie ein exotisches Bibliotheksformat verwenden, ist es eine gute Idee, es in DIA-NNs .parquet zu konvertieren und dann die resultierende Bibliothek (mit dem R-Paket „arrow“ oder dem Python-Paket „pyarrow“) zu untersuchen, um festzustellen, ob der Inhalt sinnvoll ist.
Alle .tsv/.xls/.txt/.csv/.parquet-Bibliotheken sind lediglich einfache Tabellen mit für Menschen lesbaren Daten und können bei Bedarf mit Excel oder (idealerweise) R/Python untersucht/bearbeitet werden.
Wichtig ist, dass bei der Konvertierung einer Bibliothek in ein anderes Format alle Zahlen mit einer bestimmten Dezimalgenauigkeit gerundet werden können, was bedeutet, dass sie möglicherweise nicht genau mit der Originalbibliothek übereinstimmen (es kann zu geringfügigen Unterschieden kommen). Obwohl die Leistung bei der Analyse mit einer konvertierten Bibliothek vergleichbar ist, stimmen die Ergebnisse nicht genau überein.
Im Ausgabebereich können Sie angeben, wo die Ausgabe gespeichert werden soll, sowie die Dateinamen für den Hauptausgabebericht und (optional) die Ausgabespektralbibliothek festlegen. DIA-NN verwendet diese Dateinamen, um die Namen aller seiner Ausgabedateien abzuleiten. Nachfolgend finden Sie Informationen zu verschiedenen Arten der DIA-NN-Ausgabe. Für die meisten Arbeitsabläufe benötigt man lediglich den Hauptbericht (zur Analyse in R oder Python – empfohlen) oder die Matrizen (vereinfachte Ausgabe für MS Excel). Wenn die Generierung von Ausgabematrizen aktiviert ist, erstellt DIA-NN auch eine .manifest.txt-Datei mit einer kurzen Beschreibung der generierten Ausgabedateien.
Eine Texttabelle mit Vorläufer- und Protein-IDs sowie zahlreichen zugehörigen Informationen. Die meisten Spaltennamen sind selbsterklärend und die vollständige Referenz finden Sie in der Hauptausgabereferenz. Bei der Benennung von Spalten werden folgende Schlüsselwörter verwendet:
Hinweis: Seit Version 1.9 erstellt DIA-NN einen Bericht im Apache .parquet-Format. Dies ist ein komprimiertes Texttabellenformat (ca. 10-fache Größenreduzierung), das mit dem R-Paket „arrow“ oder dem Python-Paket „pyarrow“ in einer einzigen Codezeile geladen werden kann. Die meisten neuen Funktionen (eingeführt in DIA-NN 1.9) spiegeln sich nur im Parquet-Bericht wider, daher wird empfohlen, ihn in allen Fällen anstelle des alten .tsv-Berichts zu verwenden, während der .tsv-Bericht weiterhin nur aus Kompatibilitätsgründen mit generiert wird alte Analyse-Workflows. Die Generierung des alten .tsv-Berichts kann mit --no-main-report ausgeschaltet werden. Zusätzlich zur Verwendung von R oder Python können Sie .parquet-Dateien auch mit dem TAD Viewer anzeigen.
Diese enthalten normalisierte MaxLFQ-Größen für Proteingruppen ('pg_matrix'), Gengruppen ('gg_matrix'), einzigartige Gene ('unique_genes_matrix'; dh Gene, die nur mithilfe proteotypischer, also genspezifischer Peptide identifiziert und quantifiziert wurden) sowie normalisierte Mengen für Vorläufer ('pr_matrix'). Sie werden mit 1 % FDR gefiltert, wobei globale Q-Werte für Proteingruppen und sowohl globale als auch laufspezifische Q-Werte für Vorläufer verwendet werden. Auf die Proteinmatrizen wird ein zusätzlicher 5 % laufspezifischer FDR-Filter auf Proteinebene angewendet. Verwenden Sie --matrix-spec-q, um ihn anzupassen. Manchmal meldet DIA-NN eine Null als beste Schätzung für eine Vorläufer- oder Proteinmenge. Solche Nullmengen werden in Protein-/Genmatrizen weggelassen. Spezielle Phosphosite-Quantifizierungsmatrizen (Phosphosites_90 und Phosphosites_99 .tsv) werden generiert, wenn Phosphorylierung (UniMod:21) als variable Modifikation deklariert wird, siehe PTMs und Peptidoformen.
Die Datei .protein_description.tsv wird zusammen mit den Matrizen generiert und enthält grundlegende Proteininformationen, die DIA-NN bekannt sind (Sequenz-IDs, Namen, Gennamen, Beschreibung, Sequenz). Zukünftige Versionen von DIA-NN werden weitere Informationen enthalten, z. B. das Molekulargewicht des Proteins.
Enthält eine Reihe von QC-Metriken, die zur Datenfilterung verwendet werden können, z. B. um fehlgeschlagene Läufe auszuschließen oder als Messwert für die Methodenoptimierung. Beachten Sie, dass die hier angegebene Anzahl der Proteine der Anzahl der einzigartigen Proteine (dh identifiziert mit proteotypischen Vorläufern) in einem bestimmten Lauf bei einem Q-Wert des einzigartigen Proteins von 1 % entspricht. Diese Zahl kann aus dem Hauptbericht reproduziert werden, der mit einem Vorläufer-FDR-Schwellenwert von 100 % erstellt und mit Protein.Q.Value <= 0,01 und Proteotypic == 1 gefiltert wurde. Was hier als „Protein“ gezählt wird, hängt von der Einstellung „Proteininferenz“ ab.
Eine Visualisierung einer Reihe von QC-Kennzahlen, basierend auf dem Hauptbericht und dem Statistikbericht. Der PDF-Bericht sollte nur zur schnellen Vorbeurteilung der Daten verwendet werden und nicht in Veröffentlichungen verwendet werden.
Im Ausgabebereich können Sie steuern, wie mit den „.quant-Dateien“ umgegangen wird. Um diese zu erklären, betrachten wir nun, wie DIA-NN Rohdaten verarbeitet. Es führt zunächst den rechenintensiven Teil der Verarbeitung separat für jeden einzelnen Versuchsdurchlauf durch und speichert die Identifizierungen und quantitativen Informationen in einer separaten .quant-Datei. Sobald alle Läufe verarbeitet sind, sammelt es die Informationen aus allen .quant-Dateien und führt einige laufübergreifende Schritte durch, wie z. B. die Berechnung des globalen Q-Werts, die Proteininferenz, die Berechnung der Endmengen und die Normalisierung. Dadurch ist DIA-NN sehr flexibel einsetzbar. Beispielsweise können Sie die Verarbeitung jederzeit stoppen und dann mit der Verarbeitung fortfahren, beginnend mit dem Lauf, bei dem Sie angehalten haben. Oder Sie können einige Läufe aus dem Experiment entfernen, einige zusätzliche Läufe hinzufügen und die Analyse schnell erneut ausführen, ohne die Analyse der bereits verarbeiteten Läufe wiederholen zu müssen. All dies wird durch die Option Vorhandene .quant-Dateien verwenden, wenn verfügbar ermöglicht. Die .quant-Dateien werden im Temp/.dia-Verzeichnis gespeichert bzw. daraus gelesen (oder am selben Ort wie die Rohdateien, wenn kein temporärer Ordner angegeben ist). Bei Verwendung dieser Option muss der Benutzer sicherstellen, dass die .quant-Dateien mit genau denselben Einstellungen generiert wurden, die in der aktuellen Analyse angewendet wurden, mit Ausnahme von Precursor FDR (vorausgesetzt, es ist <= 5 %), Threads , Protokollebene , MBR , Cross-Run-Normalisierung und Bibliotheksgenerierung – diese Einstellungen können unterschiedlich sein. Tatsächlich ist es sogar möglich, .quant-Dateien auf einen anderen Computer zu übertragen und dort wiederzuverwenden – ohne die ursprünglichen Rohdateien zu übertragen. Wichtig: Es wird dringend empfohlen, .quant-Dateien nur dann wiederzuverwenden, wenn sowohl die Massengenauigkeit als auch das Scanfenster auf bestimmte Werte (ungleich Null) festgelegt sind. Andernfalls führt DIA-NN beim ersten Durchlauf, für den ein . Quant-Datei wurde nicht gefunden. Wenn Sie außerdem MBR verwenden oder eine Spektralbibliothek aus DIA-Daten erstellen und die Bibliotheksgenerierung auf Smart oder Full Profiling eingestellt ist, sollten .quant-Dateien nur dann wiederverwendet werden, wenn sie in genau derselben Reihenfolge wie die aktuelle Reihenfolge der Rohdateien generiert wurden mit MBR DIA-NN kann derzeit nicht mehrere separate Analysen miteinander kombinieren.
Hinweis: Der Hauptbericht im .parquet-Format liefert die vollständigen Ausgabeinformationen für jede Art der nachgelagerten Verarbeitung. Alle anderen Ausgabearten dienen dazu, die Analyse bei Verwendung von MS Excel oder ähnlicher Software zu vereinfachen. Die Anzahl der Vorläufer und Proteine, die in verschiedenen Arten von Ausgabedateien gemeldet werden, kann aufgrund der unterschiedlichen Filterung, die für deren Generierung verwendet wird, unterschiedlich aussehen. Weitere Informationen finden Sie in den Beschreibungen oben. Alle „Matrizen“ können aus dem .parquet-Hauptbericht reproduziert werden, wenn sie mit R oder Python mit auf 5 % gesetztem Vorgänger-FDR generiert werden.
DIA-NN verfügt über ein sehr fortschrittliches bibliotheksfreies Modul, das für bestimmte Arten von Experimenten besser ist als die Verwendung einer hochwertigen projektspezifischen Spektralbibliothek. Im Allgemeinen führt Folgendes dazu, dass die bibliotheksfreie Suche im Vergleich zu Spektralbibliotheken eine bessere Leistung erbringt (während das Gegenteil Spektralbibliotheken begünstigt):
Bitte beachten Sie, dass es in 99 % der Fälle für eine quantitative bibliotheksfreie Analyse unbedingt erforderlich ist, dass MBR aktiviert ist. Es wird standardmäßig aktiviert, wenn die DIA-NN-GUI verwendet wird.
Für die meisten Experimente ist es tatsächlich sinnvoll, die bibliotheksfreie Suche auszuprobieren. Bei mittelgroßen und großen Experimenten könnte es sinnvoll sein, zunächst eine bibliotheksfreie Analyse einer Teilmenge der Daten zu versuchen, um zu sehen, ob die Leistung in Ordnung ist (auf der gesamten Datenmenge wird sie normalerweise viel besser sein, das ist also nicht nötig). hier zu streng). Wir selbst führen häufig auch eine schnelle vorläufige QC-Bewertung des Experiments mithilfe einer öffentlichen Bibliothek durch.
Es ist oft praktisch, eine bibliotheksfreie Analyse in zwei Schritten durchzuführen: indem man zunächst eine in silico vorhergesagte Spektralbibliothek aus der Sequenzdatenbank erstellt und dann mit dieser Bibliothek analysiert. Dies ist die Strategie, die in allen Fällen angewendet werden muss, außer bei schnellen Voranalysen. Beachten Sie, dass die Pipeline-Funktionalität in DIA-NN die einfache Planung von Aufgabensequenzen ermöglicht, beispielsweise die Erstellung einer vorhergesagten Bibliothek, gefolgt von mehreren Analysen unter Verwendung dieser Bibliothek.
Beachten Sie, dass je größer der Suchraum (die Gesamtzahl der berücksichtigten Vorläufer) ist, desto schwieriger ist es für die Analysesoftware, Peptide zu identifizieren, und desto länger dauert die Suche. DIA-NN ist sehr gut im Umgang mit sehr großen Suchräumen, aber selbst DIA-NN kann mit einem Suchraum von 100 Millionen nicht zaubern und so gute Ergebnisse liefern wie mit einem Suchraum von 2 Millionen. Daher muss man darauf achten, alle möglichen Variablenänderungen gleichzeitig zu ermöglichen. Beispielsweise ist es wahrscheinlich keine gute Idee, maximal 5 variable Modifikationen zuzulassen und gleichzeitig Methioninoxidation, Phospho und Desamidierung zu ermöglichen.
Hier liegt ein wichtiger Unterschied zwischen DIA- und DDA-Datenanalyse. In DDA ist es sehr sinnvoll, alle möglichen Variablenmodifikationen zuzulassen, auch weil die Suchmaschine das Spektrum mit etwas abgleichen muss – und wenn es nicht mit dem richtigen modifizierten Peptid übereinstimmt, wird es fälschlicherweise abgeglichen. Bei DIA ist der Ansatz grundlegend anders: Das am besten passende Spektrum wird in den Daten für jedes betrachtete Vorläuferion gefunden (dies ist eine sehr vereinfachte Ansicht, nur um das Konzept zu veranschaulichen). Daher ist es in DIA nie ein Problem, ein bestimmtes Spektrum nicht identifizieren zu können (tatsächlich sind die meisten Spektren in DIA stark gemultiplext – das heißt, sie stammen von mehreren Peptiden – und nur ein Bruchteil davon kann identifiziert werden). Und deshalb macht es nur dann Sinn, eine bestimmte Variablenänderung zu aktivieren, wenn Sie entweder speziell daran interessiert sind oder wenn die Änderung wirklich allgegenwärtig ist.
Informationen zur Unterscheidung zwischen Peptidoformen mit unterschiedlichen Modifikationssätzen finden Sie unter PTMs und Peptidoformen.
DIA-NN kann aus jedem DIA-Datensatz eine Spektralbibliothek erstellen. Dies kann sowohl im spektralbibliothekbasierten als auch im bibliotheksfreien Modus erfolgen: Wählen Sie einfach die Option „Spektralbibliothek generieren“ im Ausgabebereich aus.
DIA-NN kann außerdem eine in silico vorhergesagte Spektralbibliothek entweder aus einer Sequenzdatenbank (stellen Sie sicher, dass FASTA Digest aktiviert ist) oder einer anderen Spektralbibliothek (häufig nützlich für öffentliche Bibliotheken) erstellen: Führen Sie DIA-NN einfach aus, ohne Rohdateien anzugeben Aktivieren Sie die Option zur Deep-Learning-basierten Spektren-, RTs- und IMs-Vorhersage im Bereich „Precursor-Ionen-Generierung “. Die derzeit vom Deep-Learning-Prädiktor unterstützten Modifikationen sind: C(cam), M(ox), N-term Acetyl, N/Q(dea), S/T/Y(phos), K(-GG), nK( mTRAQ) und nK(TMT). Beachten Sie: Wenn das Vorhersagemodul in DIA-NN eine Änderung nicht erkennt, führt es dennoch eine Vorhersage durch und ignoriert sie einfach. Um DIA-NN stattdessen dazu zu bringen, alle Peptide mit Modifikationen zu verwerfen, die dem Prädiktor unbekannt sind, verwenden Sie --skip-unknown-mods.
Spektralbibliotheken können auch aus DDA-Daten erstellt werden, und tatsächlich ist Offline-Fraktionierung + DDA seit der Einführung der SWATH/DIA-Proteomik der „Goldstandard“ zur Erstellung von Bibliotheken. Hierfür empfehlen wir die Verwendung von FragPipe, das auf der ultraschnellen und äußerst robusten MSFragger-Suchmaschine basiert. FragPipe kann außerdem verwendet werden, um DIA-NN-kompatible Bibliotheken auch aus DIA-Daten zu erstellen, ähnlich wie DIA-NN selbst.
MBR ist ein leistungsstarker Modus in DIA-NN, der für die meisten quantitativen Experimente sowohl mit einer Spektralbibliothek als auch im bibliotheksfreien Modus von Vorteil ist. MBR führt in der Regel zu höheren durchschnittlichen ID-Nummern, aber auch zu einer viel besseren Datenvollständigkeit, d. h. zu viel weniger fehlenden Werten.
Bei der Verarbeitung eines Datensatzes sammelt DIA-NN viele nützliche Informationen, die für eine bessere Verarbeitung der Daten hätten verwendet werden können. Und genau das ermöglicht MBR. Mit MBR erstellt DIA-NN zunächst eine Spektralbibliothek aus DIA-Daten und verarbeitet dann denselben Datensatz mit dieser Spektralbibliothek erneut. Die in DIA-NN implementierte algorithmische Innovation stellt sicher, dass der FDR streng kontrolliert wird: MBR wurde anhand von Datensätzen validiert, die von 2 Läufen bis zu über 1000 Läufen reichen.
MBR sollte für jedes quantitative Experiment aktiviert sein, es sei denn, Sie verfügen über eine projektspezifische Spektralbibliothek von sehr hoher Qualität, von der Sie glauben, dass sie (i) wahrscheinlich eine nahezu vollständige Abdeckung nachweisbarer Peptide bietet. Das heißt, es macht keinen Sinn, es ohne Bibliothek zu versuchen Suche + MBR und (ii) die meisten Peptide in der Bibliothek sind im DIA-Experiment tatsächlich nachweisbar. Wenn nur (i) zutrifft, lohnt es sich möglicherweise, MBR zusammen mit der auf IDs-Profilierung eingestellten Bibliotheksgenerierung auszuprobieren.
MBR sollte nicht für nicht-quantitative Experimente verwendet werden, das heißt, wenn Sie nur eine Spektralbibliothek erstellen möchten, die Sie dann für einen anderen Datensatz verwenden würden.
Man kann MBR mithilfe eines zweistufigen Ansatzes manuell „imitieren“, was zu einer vergleichbaren Leistung führt. Führen Sie zunächst DIA-NN aus, um eine Spektralbibliothek aus den DIA-Läufen zu erstellen (das gesamte Experiment oder nur seine Teilmenge, was bei umfangreichen Experimenten oder Experimenten mit Leer-/fehlgeschlagenen Läufen viel schneller sein kann). Verwenden Sie dann diese Bibliothek, um das gesamte Experiment zu analysieren. Führen Sie DIA-NN in jedem Fall mit deaktiviertem MBR aus.
Wenn Sie MBR (oder dessen Nachahmung) verwenden und sich anstelle der quantitativen Matrizen auf den Hauptbericht von .parquet (empfohlen) verlassen, verwenden Sie die folgenden Q-Wert-Filter:
Mit DIA-NN können nahezu alle Experimente mit Standardeinstellungen erfolgreich verarbeitet werden. Im Allgemeinen wird empfohlen, Einstellungen nur dann zu ändern, wenn dies in dieser Dokumentation (wie unten) ausdrücklich empfohlen wird, für einen bestimmten Experimenttyp oder wenn es eine sehr klare und überzeugende Begründung für die Änderung gibt.
In vielen Fällen möchte man möglicherweise mehrere Parameter im Algorithmusbereich ändern.
Bitte lesen Sie auch die Anleitungen zur bibliotheksfreien Suche, zu PTMs und Peptidoformen und zum Multiplexen mit plexDIA, falls diese für Ihr Experiment relevant sind.
Beachten Sie, dass einige andere Einstellungen möglicherweise automatisch aktiviert werden, sobald Sie eine bestimmte Option in der DIA-NN-GUI auswählen. Wenn Sie beispielsweise einen In-silico-FASTA-Datenbank-Digest (für eine bibliotheksfreie Suche) durchführen oder einfach eine Spektralbibliothek aus DIA-Daten generieren möchten, wird automatisch auch MBR ausgewählt – da dies in 99 % der Fälle von Vorteil ist.
DIA-NN ist als grafische Benutzeroberfläche (GUI) implementiert, die ein Befehlszeilentool (diann.exe) aufruft. Das Befehlszeilentool kann auch separat verwendet werden, z. B. als Teil benutzerdefinierter automatisierter Verarbeitungspipelines. Darüber hinaus können Sie auch bei Verwendung der GUI im Textfeld „Zusätzliche Optionen“ Optionen/Befehle an das Befehlszeilentool übergeben. Einige dieser nützlichen Optionen werden in dieser Dokumentation erwähnt, und die vollständige Referenz finden Sie unter Befehlszeilenreferenz.
Wenn die GUI das Befehlszeilentool startet, druckt es im Protokollfenster den genauen Befehlssatz aus, den es verwendet hat. Um also das bei der Verwendung der GUI beobachtete Verhalten zu reproduzieren (z. B. wenn Sie die Analyse auf einem Linux-Cluster durchführen möchten), kann man einfach genau die gleichen Befehle direkt an das Befehlszeilentool übergeben.
diann.exe [commands]
Befehle werden in der Reihenfolge verarbeitet, in der sie angegeben werden. Bei den meisten Befehlen kann diese Reihenfolge beliebig sein.
Unter Linux ist das Semikolon ';' Das Zeichen wird als Befehlstrennzeichen behandelt, daher ist ';' als Teil von DIA-NN-Befehlen (z. B. --channels) müssen durch „;“ ersetzt werden. unter Linux für korrektes Verhalten.
Zur Vereinfachung und zur Handhabung von Experimenten, die aus Tausenden von Dateien bestehen, können einige der Optionen/Befehle in einer Konfigurationsdatei gespeichert werden. Erstellen Sie dazu eine Textdatei mit einer beliebigen Erweiterung, beispielsweise diann_config.cfg, geben Sie dort alle von DIA-NN unterstützten Befehle ein und verweisen Sie dann mit --cfg diann_config.cfg auf diese Datei (im Textfeld „Zusätzliche Optionen“ oder in der Befehl, der zum Aufrufen des Befehlszeilentools diann.exe verwendet wird).
DIA-NN bietet zwei Visualisierungsmöglichkeiten.
Skyline . Um Chromatogramme/Spektren in Skyline zu visualisieren, analysieren Sie Ihr Experiment mit MBR und einer angegebenen FASTA-Datenbank und klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Skyline“. DIA-NN startet Skyline automatisch (stellen Sie sicher, dass Sie Skyline/Skyline Daily Version 23.1.1.459 oder höher als „Administratorinstallation“ installiert haben). Derzeit unterstützt dieser Workflow kein Multiplexing und funktioniert nicht mit Änderungen in einem anderen Format als UniMod.
DIA-NN-Viewer . Analysieren Sie Ihr Experiment mit aktiviertem Kontrollkästchen „XICs“ und klicken Sie auf die Schaltfläche „Viewer“. Standardmäßig wird die Option "XICS" von "XICS" nur für die Bibliotheksfragmentionen und innerhalb von 10 Sekunden von der Elution Apex aus 10 Sekunden pro Extraktionschromatogramme hergestellt. Verwenden Sie-SIXIS [N], um das Fenster der Retentionszeit auf n Sekunden zu setzen (z. B. 60 wird Chromatogramme innerhalb einer Minute von der Spitze aus extrahieren) und-theoretische FR-FR, um alle Ladungen 1 und 2 y/b zu extrahieren -Series -Fragmente, einschließlich solcher mit gemeinsamen neutralen Verlusten. Beachten Sie, dass die Verwendung von-theoretischen FR, insbesondere in Kombination mit großem Retentionszeitfenster, eine erhebliche Menge an Scheibenraum im Ausgangsordner erfordert. Die Visualisierung selbst ist jedoch für jede Versuchsgröße effektiv augenblicklich.
HINWEIS : Die mit "XICS" extrahierten Chromatogramme werden im Apache -Parquet -Format (Dateinamen enden mit '.xquet.Parquet') gespeichert und können mit R oder Python leicht zugegriffen werden. Dies kann manchmal bequem sein, um publikationsbereite Zahlen vorzubereiten (obwohl dies auch mit Skyline- oder Dia-NN-Betrachter möglich ist) oder sogar die automatische kundenspezifische Qualitätskontrolle für die LC-MS-Leistung einzurichten.
Peptid- und Modifikationspositionen innerhalb eines Proteins können mit Alphamap durch das Mann Lab https://github.com/mannlabs/alphamap visualisiert werden.
Das Pipeline-Fenster innerhalb der Dia-NN-GUI ermöglicht das Kombinieren mehrerer Analyseschritte in Pipelines. Jeder Pipeline -Schritt ist ein Satz von Einstellungen, wie von der GUI angezeigt. Man kann solche Schritte zur Pipeline hinzufügen, vorhandene Schritte aktualisieren, Schritte entfernen, die Schritte nach oben in die Pipeline verschieben, bestimmte Schritte in der Pipeline deaktivieren/aktivieren (durch Doppelmausklick) und die Pipelines speichern/laden. Darüber hinaus können einzelne Pipeline-Schritte zwischen verschiedenen GUI-Registerkarten/Fenstern kopiert werden (dafür kopieren und einfügen). Wir bauen immer alle Dia-NN-Läufe für eine bestimmte Veröffentlichung in einer Pipeline zusammen. Man kann auch Dia-NN-Pipelines verwenden, um Konfigurationsvorlagen zu speichern.
Die Dia-NN-GUI verfügt über integrierte Workflows ( Vorläufer-Ionenerzeugungsbereich ) zum Nachweis der Methioninoxidation, der N-terminalen Proteinacetylierung, der Phosphorylierung und der Ubiquitinierung (über den Nachweis von Remnant-GGG-Addukten an Lysinen). Andere Modifikationen können mit-var-mod oder-fixiertem Mod in zusätzlichen Optionen deklariert werden.
Die Unterscheidung zwischen Peptidoformen mit verschiedenen Modifikationssätzen ist ein nicht triviales Problem in DIA: Ohne spezielle Peptidoform-Bewertung des wirksamen Peptidoform-FDR kann der Bereich von 5 bis 10% für bibliotheksfreie Analysen liegen. Dia-NN implementiert einen statistischen Zieldekorationsansatz für die Peptidoform-Bewertung, das durch die Option Peptidoforms ( Algorithmus- Bereich) aktiviert ist und auch dann automatisch aktiviert wird, wenn eine variable Modifikation über die GUI-Einstellungen oder den Befehl-VAR-MOD deklariert wird. Die resultierenden Peptidoform-Q-Werte spiegeln das Vertrauen von Dia-NN in die Richtigkeit der für das Peptid angegebenen Modifikationen sowie die Korrektheit der identifizierten Aminosäuresequenz wider. Diese Q-Werte garantieren jedoch nicht das Fehlen niedriger Massenverschiebungen aufgrund einiger Aminosäure-Substitutionen oder Modifikationen wie Desamidation (Beachten Sie, dass DDA dies auch nicht garantiert).
Darüber hinaus verfügt Dia-NN einen Algorithmus, der PTM-Lokalisierungsvertrauensschätzungen meldet (als hintere Wahrscheinlichkeiten für die korrekte Lokalisierung aller variablen PTM-Stellen auf dem Peptid sowie für einzelne Standorte), die in den Ausgangsbericht von .Parquet enthalten sind. Die Phosphosites_90- und Phosphosites_99-.TSV-Dateien enthalten Phosphose-spezifische Größen, die unter Verwendung der oberen 1-Methode (experimentell) berechnet werden. Dies ist die höchste Intensität zwischen den Vorläufern, wobei die Stelle mit dem angegebenen Vertrauen (0,9 bzw. 0,99) als Phosphosite verwendet wird Menge im gegebenen Lauf. Der "Top 1" -Algorithmus wird hier verwendet, da er wahrscheinlich die robustesten Ausreißer und Fehllokalisierungsfehler ist. Ob dies jedoch tatsächlich die beste Option ist oder nicht, muss untersucht werden, was derzeit aufgrund des Mangels an Benchmarks mit bekannter Grundwahrheit eine Herausforderung darstellt.
Im Allgemeinen empfehlen wir bei der Suche nach PTMS Folgendes:
Essentiell: Die gesuchten variablen Modifikationen müssen als Variable (über die GUI -Kontrollkästchen oder die zusätzlichen Optionen ) angegeben werden
Einstellungen für die Phosphorylierung: MAX 3 Variable Modifikationen, max. 1 Fehlgeschlagene Spaltung, Phosphorylierung ist die einzige angegebene variable Modifikation, Vorladungsladebereich 2-3; Stellen Sie sicher, dass der angegebene Vorläufermassenbereich (bei der Erzeugung einer vorhergesagten Bibliothek) nicht breiter ist als der für MS/MS ausgewählte Vorläufer -Massenbereich, der nach der DIA -Methode ausgewählt wurde (bei der Erzeugung einer vorhergesagten Bibliothek). Um die Verarbeitung bei der Verwendung einer vorhergesagten Bibliothek zu beschleunigen, generieren Sie zunächst eine DIA-basierte Bibliothek aus einer Teilmenge von Experiment-Läufen (z. B. 10+ Beste Runs) und analysieren Sie dann den gesamten Datensatz mit dieser DIA-basierten Bibliothek mit MBR deaktiviert
Wenn die oben genannten erfolgreich sind, probieren Sie auch max 2 verpasste Spaltungen
Bei der Suche nach PTMs als Phosphorylierung, in 95% der Fälle, verwenden Sie am besten max. 1 bis 3 variable Modifikationen und max.
Wenn Sie nicht nach PTMS suchen, dann, wenn das Ziel eine relative Proteinquantifizierung ist, ermöglicht das Ermöglichen von variablen Modifikationen typischerweise keine höhere proteomische Tiefe. Obwohl es normalerweise auch nicht schadet, macht es die Verarbeitung langsamer.
Nach unserem Kenntnisstand gibt es keine veröffentlichte Validierung des Identifikationsvertrauens für die Erkennung von deamidierten Peptiden (die leicht zu schwereren Isotopologen zu verwechseln sind, es sei denn Wird von der Suchmaschine verwendet) auch für DDA. Eine Möglichkeit, Vertrauen in die Identifizierung von deamidierten Peptiden zu gewinnen, besteht darin, zu prüfen, ob etwas identifiziert wird, wenn das Massendelta für Desamidation als 1,022694 anstelle des richtigen Wertes 0,984016 deklariert wird. DIA-NN führt diesen Test erfolgreich an mehreren Datensätzen (dh keine IDs werden bei der Angabe dieser "Dekoy-Modifikationsmasse" gemeldet). Wir empfehlen jedoch auch, solche "Decoy Modification Mass" -Suche auf mehreren Läufen aus dem zu analysierenden Experiment zu versuchen , wenn Sie nach deamidierten Peptiden suchen. In jedem Fall (korrekte oder Ködermasse) sollten-qvalues verwendet werden, um die PTM-spezifische Bewertung für Desamidation zu ermöglichen, zusätzlich zur Peptidoform-Bewertung und entweder PTM.Q.Value oder Global.q.Value/Lib. Q.Value zur Filterung verwendet.
Bemerkenswert ist, dass es weitgehend irrelevant ist, wenn das ultimative Ziel die Identifizierung von Proteinen ist, wenn ein modifiziertes Peptid falsch identifiziert wird, indem sie an ein Spektrum übereinstimmt, das aus einem anderen Peptidoform stammt. Wenn der Zweck des Experiments darin besteht, spezifische PTMs, Aminosäure -Substitutionen oder die Unterscheidung von Proteinen mit hoher Sequenzidentität zu identifizieren/zu quantifizieren, wird die Option Peptidoforms -Bewertungen empfohlen. In allen anderen Fällen ist die Bewertung von Peptidoform in der Regel in Ordnung, aber nicht erforderlich und führt normalerweise zu einer etwas langsameren Verarbeitung und einer leichten Abnahme der Identifikationszahlen bei der Verwendung von MBR.
Im Allgemeinen ja. Die meisten Workflows funktionieren jedoch, ohne Änderungen zu erkennen. Wenn in der Bibliothek unbekannte Änderungen festgestellt werden, drucken Sie eine Warnungsliste, und es wird dringend empfohlen, sie mithilfe von--mod zu deklarieren. Beachten Sie, dass Dia-nn bereits viele gemeinsame Modifikationen erkennt und auch die gesamte Unimod-Datenbank laden kann. Siehe die Option-Full-Unimod.
In Zusammenarbeit mit dem SLAVOV-Labor haben wir Plexdia auf der Grundlage von Dia-NN entwickelt, eine Technologie, die es ermöglicht, von nicht isobarem Multiplexing (MTRAQ, Dimethyl, SILAC) in Kombination mit DIA zu profitieren. Um ein Plexdia -Experiment zu analysieren, braucht man eine in Silico vorhergesagte oder empirische Spektralbibliothek. Dia-nn muss dann je nach Analyseszenario mit den folgenden Befehlensets geliefert werden.
Szenario 1 . Die Bibliothek ist eine reguläre markierungsfreie Bibliothek (empirisch oder vorhergesagt), und Multiplexing wird ausschließlich mit der Isotopenmarkierung erreicht, dh ohne chemische Markierung mit Tags wie MTRAQ oder Dimethyl. Dia-nn benötigt dann die folgenden Optionen, um zu zusätzlichen Optionen hinzugefügt zu werden:
Beispiel für L/H SILAC -Etiketten auf K und R:
--fixed-mod SILAC,0.0,KR,label
--lib-fixed-mod SILAC
--channels SILAC,L,KR,0:0; SILAC,H,KR,8.014199:10.008269
--original-mods
Beachten Sie, dass im obigen SILAC als Etikett deklariert wird, dh es soll die Retentionszeit des Peptids nicht ändern. Hier ist es auch ein Label mit Nullmasse, da es nur dazu dient, die markierten Aminosäuren zu bezeichnen. Was die Kombination aus-fixiertem Modus und -Lib-fixiertem Mod hier tut, wird einfach (siLac) nach jedem K oder R in der Vorläufer-ID-Sequenz in der durch Dia-NN verwendeten internen Bibliotheksdarstellung gesetzt. -Channel teilt dann jeden Bibliothekseintrag in zwei, eine mit den Massen 0 (k) und 0 (r) auf jedes Auftreten von k (silac) oder r (silac) in der Sequenz hinzu, und ein anderer mit 8.014199 (k) (k) ) und 10.008269 (R).
Szenario 2 . Die Bibliothek ist eine reguläre markierungsfreie Bibliothek (empirisch oder vorhergesagt), und Multiplexing wird durch chemische Markierung mit MTRAQ erreicht.
Szenario 2: Schritt 1. Beschriften Sie die Bibliothek in Silico mit MTRAQ und führen Sie den Deep Learning Predictor aus, um Spektren/RTs/IMs anzupassen. Aus diesem Grund führen Sie Dia-NN mit der Eingabebibliothek im Feld Spectral Library aus, einer angegebenen Ausgabebibliothek , der aktivierten Lernbasis-Spektren, der RTS und der IMS-Vorhersage , der Liste der leeren Rohdatendateien und den folgenden Optionen in zusätzlichen Optionen :
--fixed-mod mTRAQ,140.0949630177,nK
--lib-fixed-mod mTRAQ
--channels mTRAQ,0,nK,0:0; mTRAQ,4,nK,4.0070994:4.0070994;mTRAQ,8,nK,8.0141988132:8.0141988132
--original-mods
Verwenden Sie die vorgesehene Datei .
Szenario 2: Schritt 2. Führen Sie Dia-nn mit den folgenden Optionen aus:
--fixed-mod mTRAQ,140.0949630177,nK
--channels mTRAQ,0,nK,0:0; mTRAQ,4,nK,4.0070994:4.0070994;mTRAQ,8,nK,8.0141988132:8.0141988132
--original-mods
Beachten Sie, dass-Lib-fixiertes-mod nicht mehr erforderlich ist, da die in Schritt 1 generierte Bibliothek bereits (MTRAQ) am N-Terminus und Lysine jedes Peptids enthält.
Szenario 3 . Die Bibliothek ist eine reguläre markierungsfreie Bibliothek (empirisch oder vorhergesagt), und Multiplexing wird durch chemische Markierung mit einem anderen Etikett als MTRAQ erreicht. Der Grund, warum dieses Szenario anders behandelt wird als Szenario 2, ist, dass Dia-NNs im Silico-Prädiktor nicht speziell für andere Etiketten als MTRAQ trainiert wurde, und daher ist ein zusätzlicher Schritt zur Generierung von Vorhersagen nicht erforderlich. Führen Sie einfach Dia-nn aus, wie Sie es in Szenario 1 tun würden, außer dass die-fixierte Modelle Erklärung in diesem Fall eine Masse ungleich Null aufweist und kein Etikett ist. Zum Beispiel für 5-Kanal-Dimethyl, wie von Thielert et al. Beschrieben:
‐‐fixed‐mod Dimethyl, 28.0313, nK
--lib-fixed-mod Dimethyl
‐‐channels Dimethyl,0,nK,0:0; Dimethyl,2,nK,2.0126:2.0126; Dimethyl,4,nK,4.0251:4.0251; Dimethyl,6,nK,6.0377:6.0377; Dimethyl,8,nK,8.0444:8.0444
--original-mods
Szenario 4 . Die Bibliothek ist eine empirische DIA-Bibliothek, die von Dia-NN aus einem Multiplex-DIA-Datensatz erzeugt wird. Dies könnte beispielsweise eine Bibliothek sein, die von Dia-nn im ersten Pass von MBR erzeugt wird (und Sie möchten sie wiederverwenden, um dasselbe oder andere Läufe zu analysieren). Die zusätzlichen Optionen sind dann die gleichen wie in Szenario 1, Szenario 2: Schritt 2 oder Szenario 3, außer (wichtig!)---lib-fixierte Mod darf nicht geliefert werden.
In allen oben genannten Szenarien muss eine zusätzliche Option angegeben , in der die Normalisierungsstrategie angegeben wird. Dies kann entweder-Channel-Norm (gepulster Silac, Proteinumsatz) oder -Channel-Spec-Norm (Multiplexing unabhängiger Proben) sein.
Ausgabe . Wir empfehlen, den Hauptbericht im .Parquet -Format für alle nachgeschalteten Analysen zu verwenden. Beachten Sie, dass PG.q.Value und GG.q.Value im Hauptbericht bei Verwendung von Multiplexing kanalspezifisch sind. Die Mengen pg.maxlfq, gene.maxlfq und gene.maxlfq.unique sind nur kanalspezifisch, wenn (i) Quanten verwendet werden, und (ii) entweder der Bericht entspricht dem zweiten Durchgang von MBR oder MBR nicht. Alternativ kann man die Matrizen verwenden (nicht empfohlen), diese sind nur Vorläuferebene. Bei der Verwendung von Matrizen ist es unbedingt wichtig,-Matrix-ch-QValue mit angemessenen Schwellenwerten 0,01 bis 0,5 anzugeben. Diese Einstellung wirkt sich nicht auf die extrahierte MS1 -Matrix aus, in der einfach MS1 -Signale angegeben werden, die jedem Kanal entsprechen, wenn ein Vorläufer in einem der Kanäle identifiziert wird - wird normalerweise nicht empfohlen, wenn diese Matrix verwendet wird. Proteinmatrizen werden bei der Analyse von Multiplexdaten nicht erzeugt.
Eingabebereich
Vorläufer -Ionengenerierungsscheibe
Ausgangsscheibe
Algorithmusscheibe
Beachten Sie, dass einige Optionen unten stark nachteilig sind und nur für Benchmarking -Zwecke da sind. Die Empfehlung ist daher, nur die Optionen zu verwenden, die für ein bestimmtes Experiment (z. B. die in der vorliegenden Dokumentation empfohlenen empfohlenen Dokumentation) basierend auf einiger klarer Begründung von Vorteil sind.
