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ビナクル - グラフ足場のカバレッジを推定し、既存のメタゲノムビニングツールと統合します

Binnacleは、グラフ足場のカバレッジを正確に計算し、MetaBat2、Maxbin 2.0、Concoctなどの主要なビニング方法とシームレスに統合します。ビニングのためのコンティグ（最も一般的なアプローチ）とは対照的に、グラフ足場を使用すると、メタゲノムビンの連続性と品質が向上し、再構築されたゲノムのより広範なセットのセットをキャプチャできます。

インストール

Binnacleを実行するには、Python 3.7.x、Bedtools、Samtools、Biopython、NetworkX、Numpy、およびPandasが必要です。
Environment.ymlファイルが利用可能で、これを使用して、Binnacleを実行するのに適したコンドラ環境を作成できます。これらのパッケージをインストールする方法に関する詳細なドキュメントは、こちらをご覧ください。 Metacarvel足場ツールの出力であるグラフ足場を使用するため、Metacarvelをダウンロードしてインストールする必要があります。 Metacarvelのステップバイステップインストールガイドがあります。

メタゲノムデータをビニングします

一般に、1つまたは複数のメタゲノムサンプルがある場合は、各サンプルから組み立て、足場、およびビンコンティグ/足場をメタゲノミックビンを生成する必要があります。 Megahitを組み立てに使用し、Metacarvelを足場に使用することをお勧めします。ここでは、アセンブリ、足場、およびベースごとのカバレッジの推定手順を通じて作業するヘルパーガイドを提供します。

これらの手順に従って、グラフ足場でビニング方法を実行するためのファイルを生成します。

正確な足場（ミススコーフォールドモジュール）を生成し、足場のスパンとカバレッジを推定します。
この手順では、Metacarvel Output Directoryからのグラフ足場と、入力と同じサンプルの読み取りを使用してコンティグのカバレッジが推定されます。グラフ足場の正確なセットのカバレッジ推定値と、出力ディレクトリ内の座標、方向などに関する他の必要な情報を出力します。コンティグレベルのカバレッジは、Perbaseカバレッジを説明するテキストファイル、または読み取りアライメントのBAMおよびベッドファイルのいずれかとしてBinnacleに提示できます。

 python Estimate_Abundances.py -g [ORIENTED.gml] -a [COVERAGE_SORTED.txt] -c [CONTIGS.fa] -d [OUTPUT_DIRECTORY]
usage: Estimate_Abundances.py [-h] [-g ASSEMBLY] [-a COVERAGE] [-bam BAMFILE]
                              [-bed BEDFILE] [-c CONTIGS] -d DIR [-o COORDS]
                              [-w WINDOW_SIZE] [-t THRESHOLD]
                              [-n NEIGHBOR_CUTOFF] [-p POSCUTOFF]
                              [-pre PREFIX]

binnacle: A tool for binning metagenomic datasets using assembly graphs and
scaffolds generated by metacarvel. Estimate_Abundances.py estimates abundance
for scaffolds generated by MetaCarvel. If the coordinates computed by binnacle
is specified then the abundance for each scaffold is estimated based on the
contig abundances and the coordinates. If the coordinates are not specified
then binnacle etimates the abundance from scratch. While calculating all vs
all abundances please specify the coordinates(Coordinates_After_Delinking.txt)
through the "coords" parameter. The abundances can be provided as a bed file,
bam file or a text file describing the per base coverage obtained by running
the genomeCoverageBed program of the bedtools suite.

optional arguments:
  -h, --help            show this help message and exit
  -g ASSEMBLY, --assembly ASSEMBLY
                        Assembly Graph generated by Metacarvel
  -a COVERAGE, --coverage COVERAGE
                        Output generated by running genomecov -d on the bed
                        file generated by MetaCarvel.
  -bam BAMFILE, --bamfile BAMFILE
                        Bam file from aligning reads to contigs
  -bed BEDFILE, --bedfile BEDFILE
                        Bed file from aligning reads to contigs. If bed file
                        is provided please provide a fasta file of the contigs
  -c CONTIGS, --contigs CONTIGS
                        Contigs generated by the assembler, contigs.fasta
  -d DIR, --dir DIR     output directory for results
  -o COORDS, --coords COORDS
                        Coordinate file generated by Binnacle
  -w WINDOW_SIZE, --window_size WINDOW_SIZE
                        Size of the sliding window for computing test
                        statistic to identify changepoints in coverages
                        (Default=1500)
  -t THRESHOLD, --threshold THRESHOLD
                        Threshold to identify outliers (Default=99)
  -n NEIGHBOR_CUTOFF, --neighbor_cutoff NEIGHBOR_CUTOFF
                        Filter size to identify outliers within (Defualt=100)
  -p POSCUTOFF, --poscutoff POSCUTOFF
                        Position cutoff to consider delinking (Default=100)
  -pre PREFIX, --prefix PREFIX
                        Prefix to be attached to all outputs

読み取りからサンプルのグラフ足場のカバレッジを推定する場合は、次のパラメーターを使用してastimate_abundances.pyを実行します。

 -g Path to oriented.gml from running metacarvel on sample
-c Path to contigs obtained by assembling reads of sample
-a Coverage of contigs in ths sample by mapping to its reads -- See Wiki for how to calculate coverage information
-d Output directory

複数のサンプルを使用する場合、同じサンプルの読み取りを使用して、足場を「修正」し、そのスパンを推定します。ただし、他のすべてのサンプルの読み取りを使用して、サンプル全体のグラフ足場のカバレッジを推定できます。複数のサンプルからの情報を使用すると、ビンニングフェーズのノイズを減らすことができ、それを強く推奨します。したがって、別のサンプル（サンプル2）の読み取りからグラフ足場（サンプル1）のカバレッジを推定する場合は、これらの変更を使用してatimate_abundances.pyを実行します。

 -a Coverage of contigs in Sample 1 by mapping reads of Sample 2 -- See Wiki for how to calculate coverage information
-o Coordinates of scaffolds from Sample 1 that you would have generated from the previous step.
-d Same output directory as Sample 1

すべてのサンプル（すべて対すべて）からのグラフ足場のカバレッジを推定したら、この情報を組み合わせて、メタゲノームビニング方法を実行するためにファイルを生成する必要があります。 MetaBAT2、COMOCT、およびMAXBIN2.0で簡単に使用できるファイルを提供します。

クラスタリング用の機能マトリックスを生成するには、Binnacleのcollate.pyプログラムを使用します。出力ディレクトリへのパスは、前の手順で生成されたすべての要約情報が配置され、次に実行したいビニング方法があります。

 python Collate.py -h                        
usage: Collate.py [-h] -d DIR [-m METHOD] [-k KEEP]

binnacle: A tool for binning metagenomic datasets using assembly graphs and
scaffolds generated by metacarvel.Estimate_Abundances.py estimates abundance
for scaffolds generated by MetaCarvel. The program Collate.py collects the
summary files generated by Estimate_Abundances.py

optional arguments:
  -h, --help            show this help message and exit
  -d DIR, --dir DIR     Output directory that contains the summary files
                        generated by running Estimate_Abundances.py
  -m METHOD, --method METHOD
                        Binning method to format the output to. Presently we
                        support 1. Metabat 2. Maxbin 3. Concoct 4. Binnacle
                        (Default)
  -k KEEP, --keep KEEP  Retain the summary files generated by
                        Estimate_Abundances.py. Defaults to True

前のステップで選択されたメソッド（-m）に基づいてabundances.txtファイルを使用して、そのビニング方法を実行してグラフ足場のビンを生成できます。

Python環境のセットアップに関する詳細な説明、カバレッジを計算する方法、およびBinnacleを実行する典型的なワークフローについては、Wikiをチェックアウトしてください。

グラフの足場を視覚化するには、WebベースのブラウザであるMetagenomescopeを使用することをお勧めします。 Metagenomescopeへの入力はAssembly_graph_filtered.gmlです。 MetagenomeScopeのインストールと実行に関する詳細なドキュメントは、こちらをご覧ください。